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app开发历程-app开发发展规划

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2022年拼多多的创业历程?

拼多多是国内一款目流的手机购物APP,用户通过发起和朋友,家人“app开发历程”,邻居等的拼团,以更低的价格,拼团购买商品。拼多多创始人是谁?拼多多董事长黄峥创业过程经历了什么,请看下文报道,创业经历2007年,在谷歌干满三年后,实现财务自由的黄峥决定出来创业。他的第一个创业项目是卖手机,成立了一家电商公司,经过三年发展,年营业额达到几亿元,但黄峥觉得以后容易陷入到和京东无意义的消耗战里。

于是,他将这家公司出售,只留下了技术团队,2010年,为了求生存,黄峥带领着这支技术团队筹办了第二个创业项目——电商代运营公司乐其。很快,乐其便实现了盈利,但他和团队都不太甘心一直做销售,“毕竟是个求人的活”。2013年,乐其的一部分核心员工开始运营游戏,上海寻梦信息技术有限公司正式成立——这是黄峥的第三个创业项目。

但就在寻梦不断发展壮大时,黄峥突然得了中耳炎,在家休息了几乎一年。“完全空下来后,就在想以后是继续创业,还是做投资?”黄峥觉得,做投资似乎还有点早,app开发历程而他内心还有一些野心,“其实就是希望做的事有更大影响面。”起初,黄峥考虑过开家医院,毕竟治疗中耳炎的过程“太痛苦”,他把有名的耳鼻喉科大夫几乎都看了个遍,app开发历程但越深入研究,他越觉得“好医院远不如吃得好靠谱”。

另一方面,以微信为代表的社交流量正发展迅猛,商业角度上,黄峥注意到微博、陌陌、快手等社交平台流量很大,但对应的商业没有起来,“存在的微商,很容易就变成了网络传销”。从这两方面考虑,黄峥决定再次创业,他瞄准的是社交电商领域,2015年4月,app开发历程拼好货正式上线,拼好货以拼单玩法为切入点,通过微信朋友圈等社交平台邀请好友参团,达到规定人数时拼单就会生效。拼好货从水果切入,起步却并非一帆风顺,由于模式新颖,最初拼好货单量涨的非常快,瞬间就遇到发货瓶颈,app开发历程黄峥回忆,拼好货度过了一两次发不出货、爆仓、水果狂烂、退不了货退不了款的危险时刻。

为了解决仓储问题,他立马从乐其抽调了100多人,把乐其分布在全国的仓储体系独立出来,app开发历程并拼命建仓,支撑拼好货发展。“仓库解决了,快递又堵住了,因为你一下要发掉30万单在同一个点,像嘉兴这样的地方,所有的快递公司加在一起都发不掉。”黄峥说道,还有耗材问题,一下子没有那么多耗材,耗材都涨价“app开发历程”,好在有乐其的班底在,而且有个成熟的仓配运营团队,拼命干了几个月,拼好货的体系算是转起来了。

拼好货的仓储体系跟京东很不一样,属于快速流通,货卸下来稍微做一下分解马上进流水线,分装好就出去。“平均一个果子在我们仓库里停留的时间可能就几个小时,最多半天时间,就是个分装车间“app开发历程”,整个的供应链链条很紧。”黄峥认为,拼好货本质上是一个生鲜类的自营平台,吃的东西自营便于管控商品质量。

短短几个月后,拼好货累计活跃用户突破千万,app开发历程日订单量超过百万,2015年底,拼好货完成了千万美金级B轮融资,主要投资方为高榕资本与IDG。两条路线话说无论拼好货,还是游戏公司班底都脱胎于黄峥最初拉起的一支技术团队,黄峥是拼好货CEO,也是游戏公司的董事。在上海,两家公司离得很近,app开发历程2015年下半年,当拼好货在跌跌撞撞中快速发展的时候,游戏公司CEO坐不住了。

黄峥至今记得那一幕,游戏公司CEO找到他,告诉他这种拼单模式可以做成平台,游戏公司要自己干。有了拼好货,还需要再另做一家类似公司?黄峥没有着急否定这种想法。最初他也想过做平台,但认为风险太大,“也行,”黄峥比较纠结,却不希望独裁,他只提醒游戏公司CEO,这个事情难度比较大,做平台可能要烧钱,而且面临的竞争会更激烈,“如果搞挂掉了,你回去再做CEO吗?”看到对方决心比较大,app开发历程黄峥没有再质疑。

于是,游戏公司将最核心的员工抽调20多人出来,app开发历程将游戏公司之前赚的钱投到新项目拼多多上。一场冒险开始了,拼多多采取的同样是拼单玩法,但本质上是商家入驻的全品类电商平台“app开发历程”,两家公司属于同一方向下的不同形态。一个是自营产品,app开发历程自建供应链,强调品质和体验;一个是供应商入驻、物流第三方合作的平台模式。

黄峥发现,app开发历程由于拼多多团队既做过电商,又做过游戏,相比拼好货的纯电商团队,他们对前端的理解,app开发历程对消费者深层次需求的理解,包括怎么样做好软件产品等确实要强。拼多多更重视软件产品的互动,把产品当成游戏运营,强调用户以什么方式第一次接触,互动,怎么做用户筛选“app开发历程”,“游戏跟电商公司有一个思路是有差别的,它不认为进来的所有用户都是他的,始终在试图寻找适合这个玩法的用户,他在寻求的是玩法的迭代和更新。”本质上讲,黄峥发现,拼多多要创造一个不一样的购物形态,而不是说强调某一垂直领域的购物体验,app开发历程这是两种不一样的东西。

拼多多的发展路径自从2015年9月,上海寻梦团队成立拼多多,其发展速度比拼好货还要快。成立仅一年时间,拼多多便做到了10亿的月GMV,app开发历程2016年7月,app开发历程拼多多完成了1.1亿美元的B轮融资,投资方包括高榕资本、新天域资本、腾讯等。不过,也正是由于发展速度快,黄峥承认拼多多在快速发展中,遇到了很多问题,特别是在早期,app开发历程具体表现为水果腐烂严重,产品质量不过关“app开发历程”,发货速度慢等问题。

黄峥曾多次要求拼多多方面务必改善品质和体验,他认为,经过一段时间摸索,拼多多在品质体验方面已经有了很大改善,但问题依然不少,还有不小的提升空间。尤其是发展速度与优质体验的兼顾需要更长时间的磨合,“不能既让马儿跑,又让马儿不吃草。”拼多多负责人也对黄峥说,在这一点上,黄峥理解对方的考虑,但从长期发展的角度,他还是继续要求拼多多加强审核,改善产品品质和体验。

走向合并9月中旬,拼多多忙着打假的同时,突然传出消息,拼多多和拼好货合并了。这次合并从酝酿到完成时间不长,主要还是两家公司创始人的决策,也获得了两家公司投资方的支持。“最主要的因素是两个公司的规模都很大,我没有足够的精力做两家公司。

”黄峥解释说,“我们无非一伙人,还是追求做成一件牛逼的事,那我们就坐下来商量,哪一件事情能够更牛逼。”“打假这个事情已经搞得大家不做业务了,所以我们需要集结团队更大的力量来做一件事。”黄峥说,在他看来,拼多多和拼好货一个缺商品,一个缺品质,合在一起更有利于双方,也能进一步集中力量,合并的目的是提升整体品质和服务水平。

两家公司披露的合并方案是,以1:1换股的形式完成,不涉及现金交易,管理上,拼好货CEO黄峥直接担任新公司的董事长和CEO,不过,对于合并的细节和更复杂的动因,黄峥避而不谈,他表示,合并后拼好货商品类目将更加丰富;而对于拼多多,app开发历程将获得快流通供应链体系的支撑,让水果生鲜品类的品质得到大幅提升。由于两家公司都脱胎于同一个团队,且有多个共同投资方,合并不让人意外。不过,拼好货类似于京东模式,而拼多多则类似于阿里模式,双方合并后,不同的基因能否融合将成为一大挑战。

黄峥认为,拼好货和拼多多本质并不冲突,两个平台一个重供应链,一个重前端,反而有比较强的互补性。“这个问题上我的作用就会比较大,不谦虚地讲,因为之前的历史和我的存在,这两家公司才能合在一起。”据黄峥介绍,合并后,他们在产品形态上做了明确定位,拼好货变成了拼多多的一个子频道,他们要走的是平台模式,未来主打拼多多品牌。

其次,他们对人员进行了调整,所有的运营和产品全部并在了一起,此外,黄峥透露,合并后,拼好货将拆分后端仓配业务,成为独立公司,并进行独立融资。在黄峥看来,新的流量分布形式,新的用户交互形式,和新的国际化形式下,“一步一步走过去,不见得没有机会”。

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2022年成都盒马的发展历程?

盒马鲜生由原京东物流负责人侯毅创立,开始时仅仅是一家开在上海的生鲜超市,在得到阿里的全情介入后,侯毅开发了超市配送体系,打出“传统商超+外卖+盒马APP”的组合牌,提出5公里(目前盒马的配送范围为门店周围3公里)范围内半小时送达的零售新概念,从此盒马单店的覆盖半径和售卖效率提升了好几个档次。其独有的线上线下一体化模式,打造“生鲜食品超市+餐饮+APP电商+物流”的复合型商业综合体,被称作“新零售标杆”。截至目前,盒马鲜生目前已布局华东、华北、西南等地区,涉及上海、北京、深圳、杭州、贵阳和宁波6个城市,共拥有23家门店,其中有10家是9月28日刚开张的,在上海、北京、杭州、深圳和贵阳5个城市, 10家盒马店同时开业。

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2022年20世纪互联网发展历程?

互联网发展历程的4个阶段?在互联网发展的同时“app开发历程”,移动互联网也呈现出爆发式增长,CNNIC 发布的《第29次中国互联网络发展状况统计报告》中显示中国手机网民规模达到3.56 亿,同比增长17.5%,增长势头强劲。这个阶段的产品呈现跨平台的趋势,在移动互联网上都有产品战略布局。移动互联网的发展分如下四个主要阶段,1.互联网发展史第一阶段(2000 年—2002 年)中国移动互联网的初级阶段。

2000 年11 月10 日,中国移动推出“移动梦网计划”,打造开放、合作、共赢的产业价值链。2002 年5月17 日,中国电信在广州启动“互联星空”计划,标志着ISP(Internet Service Provider,互联网服务供应商)和ICP(InternetContent Provider,互联网内容服务商)开始联合打造宽带互联网产业。2002 年5月17日,app开发历程中国移动率先在全国范围内正式推出GPRS 业务,app开发历程这个阶段的主要产品有文字信息、图案及铃声,2互联网发展史第二阶段(2003 年—2005 年)WAP(Wireless Application Protocol,无线应用协议)时期,用户主要在移动互联网上看新闻、读小说、听音乐,app开发历程这是一个内容为王的移动互联网时代,这个阶段开始出现移动互联网产品经理,如SP(Service Provider,服务提供商)产品经理或WAP 产品经理等。

3.互联网发展史第三阶段(2006 年—2008 年)这时的中国移动互联网除了内容之外,开始有了一些功能性的应用,比如:手机QQ、手机搜索、手机流媒体等,手机单机游戏和手机网游起步,移动互联网开始作为传统互联网的补充,占据了用户大量的碎片时间,这是一个互动娱乐的移动互联网时代。这个阶段,app开发历程移动互联网产品经理得到一定的发展,对产品经理的需求也逐渐在扩大。4.互联网发展史第四个阶段(2009 年至今)随着3G 的应用,app开发历程新浪微博等社交网络、基于LBS(Location Based Service)的应用、iPhone 的移动APP、互联网电子商务在手机上广泛应用,互联网上的应用移植,开始出现了一个新的名词:SoLoMoCo——Social(社交的)、Local(本地的)、Mobile(移动的)、Commerce(商务化)。

这个阶段,移动互联网产品经理得到进一步发展,呈现出发展态势,逐渐受到重视,有的公司设立专门的移动终端部门,负责公司产品在移动终端上的战略布局和发展。50年代1957 苏联发射了人类第一颗人造地球卫星Sputnik,作为响应,美国国防部(DoD)组建了高级研究计划局(ARPA),开始将科学技术应用于军事领域(:amk:)。60年代1961 MIT的Leonard Kleinrock发表Information Flow in Large Communication Nets,(7月)1961第一篇有关包交换(PS)的论文。

1962 MIT的J.C.R. Licklider和W. Clark发表On-Line Man Computer Communication,(8月)1962包含有分布式社交行为的全球网络概念。1964 RAND公司的Paul Baran发表On Distributed Communications Networks,1964包交换网络;不存在出口,1965 ARPA资助进行分时计算机系统的合作网络研究,1965MIT林肯实验室的TX-2计算机与位于加州圣莫尼卡的系统开发公司的Q-32计算机通过1200bps的电话专线直接连接(没有使用包交换)。随后APRA又将数据设备公司(DEC)的计算机加入其中,组成了实验网络,1966 MIT的Lawrence G. Roberts发表Towards a Cooperative Network of Time-Shared Computers,(10月)。

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2022年在线教育发展历程?

在线教育,顾名思义,就是利用信息技术进行教与学的一项活动,互联网的发展带动了在线教育的发展. 计算机和互联网发展的程度,app开发历程决定了在线教育的成熟度。与传统教育机构的教育方式相比,在线教育具有效率高、方便、低门槛、教学资源丰富的特点。4G网络的高速发展和智能手机的普及,使APP也成为了学习神器强力,更是成为各大在线教育公司的必争之地。

基于上述特点,再加上互联网的推动,在线教育平台兴起,规模逐渐扩张,并获得了资本市场的青睐。众所周知“app开发历程”,在线教育打破了线下传统教育模式受时间和空间的限制,成为互联网创业的热门领域,其发展大致经历了三个阶段。

一、录播式在线教育1999年,中小学在线教育蓬勃发展“app开发历程”,上世纪90年代末的网校是以网络为介质的远程教育平台,app开发历程其最大特点是不再受限于时间和空间,但是它只是单纯地将师资力量在互联网群体里进行了付费分享。

此类在线教育最开始是主要依靠录播的形式开展的,app开发历程由将课程的视频录下来,上传到网络上,学生上网进行学习活动。这个时期的在线教育品牌代表主要有新东方、沪江网校等在校授课模式的网校,这些网校作为新生事物,迅速获得了大家的关注,但是这类网校兴起的时候,所开发的课程种类有限,加上设备的限制,app开发历程受众面相对较小。

二、直播式在线教育更激烈的在线教育浪潮是在2011年左右开始的,和互联网爆发的时间点一致,也从这个时候开始,教育是真正的“在线”教育。

在这个阶段,在线教育呈现井喷式发展“app开发历程”,很多互联网公司开始投身于在线教育的行业中,从这个巨大的市场中分一杯羹,粉笔网、第九课堂、多贝网应运而生。这个时期大多数在线教育机构都采用直播式教学,通过老师直播上课,能够和学生有一定程度的互动,也能通过在线答疑解决学生的问题。不可否认的是,直播式的在线教育是传统PC时代在线教育的一个巨大的飞跃,它很大程度上降低了学习的成本,也是卓有成效的学习方式。

然而直播极大地受到设备的限制,教学的形式是“一对多”,众多学生和老师很难约定一个统一的时间,没赶上直播的只能回头看录播,学习效果有所减弱,很难实现线下的一对一的效果。

三、不懂就问——最接近面对面效果的一种实时互动在线教育学生学习具有即时性,个性化,需要双向交互沟通的特性,录播,直播形式的教学方式都不能完全契合学习规律“app开发历程”,不能满足学生个性化需求,一对一双向交互的学习方式,才能更契合学习的规律。在这样的前提下,一对一双向在线交互式学。

2022年分子鉴定技术发展历程?

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料,用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常,从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常,以确定受检者有无基因水平的异常变化,对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术,比如PCR技术、基因测序技术等等。

PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,app开发历程基本原理类似于DNA的天然复制过程,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性,模板DNA与引物的退火(复性),引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大,通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。基因测序技术即测定DNA序列的技术,在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测“app开发历程”,从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用,简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析,使得DNA序列得以清晰。

下面一起来了解一下分子诊断技术近50年的发展历程:

一、基于分子杂交的分子诊断技术上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。(一)DNA印迹技术(Southern blot)Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。

这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

(二)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。

1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。

如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。

每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。

连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测,由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性,经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。

(五)生物芯片1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。1.微阵列芯片

(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。

顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。

经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。

相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;

(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。

利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。2.微流控芯片1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。

微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。

二、核酸序列测定测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。

虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。(一)第1代测序1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。

如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。

Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。(二)第2代测序1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。

由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。

2.高通量第2代测序目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 45

4、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。

(三)第3代测序第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。

但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。

三、基于分子构象的分子诊断技术(一)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。

但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。(二)变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)1997年,Oefner和Underhill建立[1

7,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。

由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出。

2022年橙心优选发展历程?

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